Screen Quest 熒光法葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒

Screen Quest 熒光法葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于葡萄糖檢測(cè)的試劑盒，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)細(xì)胞膜。測(cè)量組織和細(xì)胞中2-葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖（2-DG）的攝取被廣泛接受作為估計(jì)葡萄糖攝取量和研究葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)和胰島素抗性機(jī)制的可靠方法。 2-DG攝取通常通過(guò)使用用氚或C14標(biāo)記的非代謝的2-DG來(lái)確定。然而，常規(guī)使用放射性標(biāo)記的探針是昂貴的并且需要繁瑣的特殊處理程序。 AAT Bioquest的Screen Quest 熒光葡萄糖攝取分析試劑盒可在細(xì)胞中提供靈敏的非放射性分析。在該測(cè)定中，2-DG被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收，并代謝成2-DG-6-磷酸（2-DG6P）。不可代謝的2-DG6P在細(xì)胞中積累，并且與細(xì)胞的葡萄糖攝取成比例。累積的2-DG6P被酶促氧化并產(chǎn)生NADPH，其通過(guò)熒光NADPH探針特異性監(jiān)測(cè)?？梢酝ㄟ^(guò)熒光酶標(biāo)儀讀取信號(hào)。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供上等的Screen Quest 熒光法葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒。 

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.平板細(xì)胞并根據(jù)需要處理細(xì)胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分鐘
3.洗滌細(xì)胞并裂解細(xì)胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室溫下孵育30至120分鐘
6.監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光增加

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
KRPH緩沖液原液（1X）：
將20mL KRPH緩沖液（5X）（組分H）加入到80mL去離子水中并充分混合。 注意：對(duì)于大約一個(gè)96孔板，50 mL體積的1×KRPH緩沖液就足夠了。 按比例準(zhǔn)備所需的音量。 將未使用的1×KRPH存放在4oC或-20oC。

2.工作溶液配制

1. NADP工作溶液：
將100μLH2O加入到NADP（組分G）的小瓶中并充分混合。

2.酶探針工作溶液：
將5mL測(cè)定緩沖液（組分F）加入酶探針瓶（組分E）中并充分混合。

3. 2-DG攝取分析工作溶液：
將100μL的NADP工作溶液加入酶探針工作溶液中并充分混合。 注意：這些數(shù)量適用于一個(gè)96孔板。

操作步驟

重要提示：該方案可用作培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞用于2-DG攝取的指導(dǎo)。

1.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以50,000-80,000細(xì)胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000細(xì)胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底細(xì)胞培養(yǎng)Poly-D賴氨酸平板培養(yǎng)4-6小時(shí)。

2.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，從孔中吸出培養(yǎng)基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）無(wú)血清培養(yǎng)基除去細(xì)胞。將細(xì)胞在37oC，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)至過(guò)夜。

3.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，從孔中吸出培養(yǎng)基，用100μL/孔1×KRPH緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞兩次。

4.加入90μL/孔葡萄糖攝取緩沖液（組分B）并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞1小時(shí)。

5.用或不用胰島素或試驗(yàn)化合物刺激20分鐘。加入10μL/孔的10×胰島素溶液至終濃度為1μM或10×化合物測(cè)試溶液。并且還向未處理的孔中加入10μL胰島素載體緩沖液或復(fù)合載體緩沖液作為對(duì)照，并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20分鐘。

6.對(duì)于葡萄糖攝取抑制研究，加入10×Phloretin至終濃度為200 uM或測(cè)試抑制劑，并在37oC，5％CO2下孵育2-5分鐘。注意：建議將10mL抑制劑載體緩沖液加入胰島素處理和未處理的孔中作為對(duì)照。 Phloretin處理的細(xì)胞可用作陽(yáng)性對(duì)照。

7.向每個(gè)孔中加入10μL/孔2-DG溶液（組分A），并在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育20-40分鐘。對(duì)于陰性對(duì)照，留下一些未經(jīng)胰島素，抑制劑和2-DG處理的孔。

8.處理后，取出每孔中的溶液，用KRPH緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，100μL/孔，從溶液中除去額外的2-DG。從孔中移除KRPH緩沖液。

9.向每個(gè)孔中加入25μL/孔酸性裂解緩沖液（組分C），并在37℃下孵育20分鐘以裂解細(xì)胞。并且可以同時(shí)制備2DG攝取測(cè)定混合物。

10.向每個(gè)孔中加入25μL/孔中和緩沖液（組分D），充分混合，在室溫下放置5-10分鐘以中和細(xì)胞裂解物。

11.向2DG6P標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)胞裂解液的每個(gè)孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。

12.在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘至2小時(shí)，避光。

13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm處截止）。