百螢為您推薦用于篩選GPCR和鈣離子通道靶標(biāo)的熒光探針

鈣通量測定是用于篩選G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的**發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)選方法。

百螢生物為您推薦由AAT研發(fā)的Quest Rhod-4?鈣檢測試劑/試劑盒，它是市場上受歡迎的紅色熒光探針Rhod-2的上乘替代品。

Rhod-2是近年來市場上*受歡迎的紅色熒光Ca2 +指示劑，可*大限度地減少化合物的自發(fā)熒光干擾。此外，其細(xì)胞中的線粒體定位和高基礎(chǔ)Ca2 +信號嚴(yán)重限制了其細(xì)胞應(yīng)用。但是，在488nm處對Rhod-2的不太理想的激發(fā)使得其與僅具有488nm激發(fā)光源的一些儀器一起使用時(shí)不太理想。AAT Bioquest研發(fā)的Quest Rhod-4?系列鈣檢測試劑，可以解決Rhod-2的這些局限性。 Quest Rhod-4?除了具有514 nm，532 nm和546 nm激發(fā)外，還可以使用488 nm的氬離子激光進(jìn)行激發(fā)，這是非常獨(dú)特的。其主要的細(xì)胞溶質(zhì)定位，長多波長激發(fā)和> 100倍熒光增強(qiáng)（與鈣形成復(fù)合物）的特點(diǎn)使得Quest Rhod-4?成為測量細(xì)胞鈣的理想指標(biāo)，特別是當(dāng)文庫化合物具有強(qiáng)熒光時(shí)并且應(yīng)用程序需要GFP的時(shí)候。我們的Quest Rhod-4?AM比細(xì)胞中的Rhod-2 AM亮4倍以上。這一特性使Screen Quest?Rhod-4?更適合HTS應(yīng)用。

Screen Quest?Rhod-4鈣測定流程圖

下圖為，通過Gq或鈣通道增加細(xì)胞溶質(zhì)中的[Ca2 +]使用Rhod-4的強(qiáng)熒光來測量。

Rhod-2與Rhod-4的比較

圖1.在96孔黑壁/透明底板中，將U2OS細(xì)胞以每100μL/孔40,000個(gè)細(xì)胞接種過夜。 除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞與100μl5μMRhod-4AM或Rhod-2AM在HHBS中于37℃溫育1小時(shí)。 用200μlHHBS洗滌細(xì)胞兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。

圖2.在HEK-293細(xì)胞中篩選Quest ^TM Rhdo-4AM和Rhod-2AM的比較。 將HEK-293細(xì)胞在96孔黑壁/透明底板中以每100μl/孔40,000個(gè)細(xì)胞接種過夜。 除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞與100μl5μMRhod-4AM或Rhod-2AM在HHBS中于37℃溫育1小時(shí)。 然后用2次HHBS洗滌細(xì)胞。 NOVOstar（BMG Labtech）添加30μMCarbachol（50μl/孔）

圖3.HEK-293細(xì)胞中的卡巴膽堿劑量反應(yīng)。 將HEK-293細(xì)胞以每孔100μL每孔40,000個(gè)細(xì)胞接種過夜，在96孔黑色壁/透明底板中。 除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞與100μl的Screen Quest ^TM Rhod-4 NW鈣測定試劑盒或5μMRhod-2 AM在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中溫育1小時(shí)。 通過NOVOstar添加卡巴膽堿（25μl/孔）以達(dá)到*終指示的濃度。 EC50為0.8μM，與文獻(xiàn)中的結(jié)果相似。

圖4. CHO-K1細(xì)胞中的ATP劑量反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以60,000個(gè)細(xì)胞/100μl/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞與100μl的Screen Quest ^TM Rhod-4 NW鈣測定試劑盒或5μMRhod-2 AM在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中溫育1小時(shí)。 通過NOVOstar添加卡巴膽堿（50μl/孔）以達(dá)到*終指示的濃度。 EC50為0.6μM，與文獻(xiàn)中的結(jié)果相似。

圖5. Screen Quest?Rhod-4 NW鈣測定試劑盒，刀豆蛋白A上的Rhod-2 AM與JurKat細(xì)胞誘導(dǎo)Ca進(jìn)入（電容鈣進(jìn)入（CCE））的比較。 將Jurkat細(xì)胞以每毫升4X106個(gè)細(xì)胞懸浮在無鈣HHBS緩沖液中，將細(xì)胞與等體積的Rhod-4 NW或Rhod-2 AM在無鈣HHBS緩沖液中以2×10 5個(gè)細(xì)胞/孔/100μL在96℃下孵育。 井黑墻/透明底板，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中1小時(shí)。 在10分鐘孵育結(jié)束時(shí)，將具有/不具有30μM的通道抑制劑SKF96365的1μg/ ml的通道開放劑伴刀豆球蛋白A加入細(xì)胞中。 NOVOstar（BMG Labtech）添加50μL/孔的HBSS和另外的24mM（5X）鈣（因此*終鈣濃度為5mM）

Rhod-4特點(diǎn)

細(xì)胞溶質(zhì)定位：Quest?Rhod-4 AM主要定位于胞質(zhì)溶膠中，而Rhod-2 AM定位于線粒體中;

多種激發(fā)： ~490 nm，514 nm，532 nm和546 nm;

信號強(qiáng)度高：在Ex 530 / Em 570下比Rhod-2 AM亮4倍。

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