1) 根據(jù)機(jī)器配置選擇*亮的熒光染料
了解你使用的流式細(xì)胞儀的性能，大多數(shù)流式細(xì)胞儀有兩個(gè)或者多個(gè)激光器，有五種波長(zhǎng)可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍(lán)色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的慮光片和檢測(cè)器也決定了你的配置可同時(shí)檢測(cè)多少種顏色。
多色標(biāo)記熒光染料盡量選用不同激光激發(fā)的染料。熒光染料在同一激光激發(fā)的染料中選擇時(shí)，優(yōu)先選擇亮度高的染料，以保證*佳分辨率。常用的高亮度染料有PE、PE/Cy5、PE/Cy7、APC、PerCP/Cy5.5、AlexaFlour 647等，但是并不是說染料亮度高，在您的流式細(xì)胞儀上就能獲得較好的信號(hào)，這還需要您的儀器的配備合適的激光、濾光片和探測(cè)器。
2) 平衡抗原表達(dá)水平和染料熒光亮度
在單色流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，我們通常會(huì)選擇亮度*強(qiáng)的幾種染料，如PE、APC等等。但是，在多色流式檢測(cè)時(shí)，有時(shí)因?yàn)轭伾南拗撇坏貌挥玫揭恍┝炼容^暗的染料。為了保證每個(gè)通道的分辨率可接受，我們需要合理搭配抗原和染料。一般來說，較暗的染料，如FITC、PerCP等，優(yōu)先分配給表達(dá)量高的抗原，而PE、APC、PerCP/Cy5.5、PE/Cy5等較亮的染料可以分配給表達(dá)量低或者分辨率要求比較高的抗原。合理配色的*終結(jié)果是讓不同表達(dá)水平的抗原檢測(cè)到的信號(hào)盡量均衡。
3) 保證搭配熒光染料的質(zhì)檢發(fā)射光譜重疊度盡量小
如前所述，當(dāng)兩種熒光染料的發(fā)射光譜重疊時(shí)，它們的熒光信號(hào)將會(huì)互相干擾，給數(shù)據(jù)分析帶來麻煩。雖然熒光補(bǔ)償技術(shù)可以將干擾扣除，但補(bǔ)償值越大，補(bǔ)償后的信號(hào)分辨率會(huì)降低越厲害。*好選擇很少或者沒有重疊的熒光基團(tuán)，以*大限度減少這種滲漏。不同激光激發(fā)的染料是優(yōu)選，如PE和APC，但在某些情況下，這可能與盡量選擇亮的熒光素的規(guī)則是沖突的。如在進(jìn)行四色分析時(shí)，經(jīng)常會(huì)將PE-Cy5標(biāo)記的抗體與APC標(biāo)記的抗體搭配使用。因?yàn)镃y5的激發(fā)波長(zhǎng)與APC的激發(fā)波長(zhǎng)相近，所以PE-Cy5與APC均可被紅色激光（640nm）所激發(fā)，而兩者的發(fā)送光譜也比較接近，導(dǎo)致PE-Cy5與APC的顏色補(bǔ)償很難調(diào)整。相反，由于PE-Cy5.5中的Cy5.5激發(fā)波長(zhǎng)為675nm，不能被紅色激光器所激發(fā)，也就不存在Cy5.5對(duì)APC的干擾，所以用PE-Cy5.5對(duì)APC計(jì)劃沒有串色。因此，可能需要犧牲個(gè)別熒光染料的亮度來避免熒光滲漏以及分辨率下降。
4) 盡量避免偶聯(lián)熒光染料使用帶來的假陽性
隨著顏色的數(shù)量不斷增加，實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到串聯(lián)熒光染料。串聯(lián)熒光染料是指通過共價(jià)鍵方式將兩種染料串聯(lián)，其中一種染料的發(fā)射光譜與另外一種染料的激發(fā)光譜部分重疊，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。串聯(lián)熒光染料很容易降解，重新分解為原來的兩個(gè)染料，從而出現(xiàn)對(duì)應(yīng)兩個(gè)通道的假陽性，若使用串聯(lián)的熒光染料，務(wù)必要在短時(shí)間內(nèi)盡快完成實(shí)驗(yàn)，曝光時(shí)間越長(zhǎng)，熒光染料就越不穩(wěn)定。在固定和透化的過程中，偶聯(lián)熒光染料的亮度可能降低，因此操作步驟應(yīng)當(dāng)盡可能溫和。