簡介
ReadiLink?快速抗體標記試劑盒提供了一種以微觀方式標記抗體的便捷方法。 該試劑盒僅需要兩個簡單的混合步驟而無需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor TM和mFluor TM染料的琥珀酰亞胺酯（SE）顯示出與蛋白質(zhì)的脂族胺的良好反應性和選擇性，并形成羧酰胺鍵，其與天然肽鍵相同且穩(wěn)定。 iFluor TM和mFluor-抗體綴合物可用于**熒光染色，熒光原位雜交，流式細胞術(shù)和其他生物學應用。 每個ReadiLink?Rapid抗體標記試劑盒都提供了進行兩次偶聯(lián)反應（2x50μg蛋白質(zhì)）的所有必需成分。 每個試劑盒可用于標記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質(zhì)（> 10 kDa），只需兩個簡單的混合步驟。
Readilink?快速試劑盒標記原理
1.通過在反應緩沖液（pH 7.5-8.5）中將標記染料與蛋白質(zhì)（待標記的）混合，開始標記反應。
2.孵育得到所需蛋白質(zhì)綴合物和非反應性游離染料的混合物。
3.通過將非熒光Tide Quencher TM（TQ）染料與反應溶液混合來淬滅反應。 TQ染料阻止反應并將非反應性自由標記染料轉(zhuǎn)化為非熒光TQ標記染料復合物，這消除了游離標記染料的背景熒光干擾。
試劑盒組成
標準操作規(guī)程（標記50μg蛋白質(zhì)）
將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結(jié)合前立即準備所需的溶液。 以下SOP是標記抗HDAC IgG抗體的實例。
1.準備蛋白質(zhì)溶液（溶液A）：
為了標記50μg蛋白質(zhì)（假設(shè)目標蛋白質(zhì)濃度為1 mg / mL），將5μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與50μL目標蛋白質(zhì)溶液混合。
注意1.如果蛋白質(zhì)濃度不同，請相應調(diào)整蛋白質(zhì)體積，使~50μg蛋白質(zhì)可用于標記反應。
注2：為了標記100μg蛋白質(zhì)（假設(shè)目標蛋白質(zhì)濃度為1 mg / mL），將10μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與100μL目標蛋白質(zhì)溶液混合。
注3：蛋白質(zhì)應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質(zhì)溶解在甘氨酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀。
注4：用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的不純抗體或抗體不能很好地標記。
注5：如果蛋白質(zhì)濃度低于1 mg / mL，結(jié)合效率會顯著降低。為獲得**標記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為1-2 mg / mL。
2.運行結(jié)合反應：
2.1將蛋白質(zhì)溶液（溶液A）加入一小瓶標記染料（組分A）中，通過反復移液幾次將其充分混合，或?qū)⑿∑繙u旋幾秒鐘。
注意：使用標記染料的兩個小瓶（組分A）通過將100μg蛋白質(zhì)分成2x50μg蛋白質(zhì)并使每個50μg蛋白質(zhì)與一小瓶標記染料反應來標記100μg蛋白質(zhì)。 將兩個小瓶合并用于下一步。
2.2將綴合反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。
注意：如果需要，可以旋轉(zhuǎn)或搖動綴合反應混合物更長的時間。
3.停止共軛反應：
3.1加入5uL（50μg蛋白質(zhì)）或10μL（100μg蛋白質(zhì)），這是TQ染色猝滅緩沖液（組分C）總反應體積的10％到共軛反應混合物中（來自步驟2.2），混合 他們很好。
3.2在室溫下孵育10分鐘。
3.3標記的蛋白質(zhì)（抗體）現(xiàn)在可以使用了。
蛋白質(zhì)共軛物的儲存
蛋白質(zhì)綴合物應在載體蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL儲存。 為了更長時間的儲存，可以將蛋白質(zhì)綴合物凍干或分成單次使用的等分試樣并在≤-20℃下儲存。
表1. AAT Bioquest ReadiLink?快速抗體標記試劑盒（2個標記/試劑盒，每個標記適用于50μg抗體）
參考文獻
1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York. 2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.
3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjugate Chem 3, 2-13.